Каталитически активная РНК-лигаза (рибозим), так же как и кольцевые, относится к некодирующим РНК.
Недавно биологам удалось обнаружить в клетках молекулы РНК в необычной кольцевой форме и установить, как именно они работают. Экзотический вид нуклеиновых кислот уже прозвали молекулами-губками из-за их способности адсорбировать другие регуляторные РНК и таким образом подавлять их активность. За последние пятнадцать лет изучение РНК превратилось в область перманентной революции, но даже на этом фоне последнее открытие выглядит знаковым событием.
За несколько лет, прошедших после открытия Уотсоном и Криком двуспиральной структуры ДНК, биологам удалось привить находившееся до того момента в воздухе дерево генетики к корню биохимии. Ученые показали, как именно загадочные гены могут проявлять себя во внешних признаках. Это понимание было оформлено в концепции, получившей слегка помпезное наименование «Основной догмы молекулярной биологии». Обычно она формулируется в виде схемы ДНК->РНК->Белок, подразумевающей однонаправленный поток информации: ДНК контролирует последовательность РНК, которая синтезируется буквально на ее основе (этот процесс называют транскрипцией — переписыванием). А последовательность РНК диктует рибосомам последовательность синтезируемого белка. Открытие РНК-содержащих вирусов слегка усложнило эту схему, но общая ее концепция оказалась удивительно живучей.Что касается некодирующих РНК, как мы сейчас их понимаем — малых молекул с регуляторными функциями, то они впервые были обнаружены в конце 1960-х годов.
О том, как это произошло, рассказал Дмитрий Александрович Крамеров, заведующий Лабораторией эволюции геномов эукариот в Институте молекулярной биологии имени Энгельгардта.
«В 1968 году нынешний академик Харрис Буш и его сотрудники с одной стороны, а также Роберт Вайнберг совместно с Шелдоном Тенноном с другой стороны обнаружили молекулы длиной всего 90–300 нуклеотидов, которые не были похожи ни на матричные, ни на транспортные РНК. Исследователи просто разделяли в гелях всю РНК, которую им удалось выделить из клеток млекопитающих, и случайно обнаружили эти относительно короткие молекулы. Их было значительно меньше, чем известных к тому моменту рибосомных и матричных РНК, но все-таки не так уж и мало.
И вот, на протяжении многих лет эти исследователи медленно и мучительно определяли последовательность этих молекул, одну за другой. Тогда они еще не знали, какие функции могут выполнять эти странные короткие РНК. В некотором смысле ученые работали на будущее. Впервые какую-то функцию у таких РНК удалось обнаружить только при исследовании сплайсинга. Это открытие принадлежит очень сильной женщине-ученому Джоан Стейтс».
Сплайсинг — это процесс, в ходе которого матричные РНК, непосредственно «переписанные» с ДНК, подготавливаются к тому, чтобы стать основой для синтеза белка. Из них вырезаются лишние участки — интроны. Оказалось, что
в процессе вырезания этих вставок участвуют малые некодирующие РНК. Белки в этом тоже участвуют, вместе с РНК они образуют большой комплекс, проводящий вырезание, — сплайсосому (структуру сплайсосомы удалось установить только недавно). Но именно РНК — они называются U1, U2, U3 и так далее — выполняют здесь основную работу.
Рис. 1. Большая субъединица
рибосомы, состоящая из РНК
(кремового цвета) и белка
(синего). Видно, что РНК является
основой этой машины трансляции,
а белок — всего лишь «довесок»,
играющий вспомогательную роль.
David S. Goodsell
Следующая малая РНК, функцию которой удалось установить, оказалась занята в процессе, никак не связанном со сплайсингом.
«Практически одновременно появились первые работы по так называемым 7S-РНК, которые входят в состав комплексов, отвечающих за экспорт белков из клетки, — SPR-частиц, — продолжает Крамеров. — Эти РНК присоединяются к первым аминокислотам белков, которые требуется экспортировать, и связывают их со специальным каналом. Это необходимо, например, для выделения пищеварительных ферментов или выработки белков крови. У каждого из таких „идущих на экспорт“ белков первые аминокислоты представляют собой определенную сигнальную последовательность, что-то вроде „разрешения на вывоз“.
Вот эта 7S-РНК как раз связывается с такой последовательностью и обеспечивает экспорт».
Со временем стало понятно, что малые некодирующие РНК встречаются в совершенно разных сферах клеточной деятельности: сплайсинг, синтез белка, экспорт белка. Были открыты малые ядрышковые РНК — молекулы, которые участвуют в модификации нуклеотидов рибосомальной РНК. Чем дальше, тем больше становилось разнообразие таких молекул, однако все они были достаточно специализированными, и такие исследования не привлекали широкого внимания. «Поначалу работа двигалась очень медленно.
Открытие роли 7S-РНК в экспорте белков, например, заняло, около пятнадцати лет. Однако в последние несколько лет новый вид малых РНК открывают чуть ли не каждый год», — рассказывает ученый.
Все изменилось относительно недавно, в 1998 году, когда Эндрю Файр и Крейг Меллоу открыли явление РНК-интерференции — способа управления работой генов, который осуществляется за счет так называемых малых интерферирующих РНК, или siRNA. Эта работа практически произвела революцию в молекулярной биологии.
- Во-первых, был обнаружен совершенно новый, неизвестный механизм регуляции работы генов.
- А во-вторых, что немаловажно, новый механизм можно было немедленно применить на практике.
Возможно, именно поэтому Нобелевскую премию Файр и Меллоу получили уже в 2006 году — спустя всего восемь лет после открытия.
В общих чертах механизм РНК-интерференции выглядит следующим образом. Как известно, для того чтобы синтезировать белок, нужно сначала снять одноцепочечную РНК-копию гена с ДНК в ядре. Созревшая матричная РНК поступает в цитоплазму, где находятся рибосомы. Однако если в клетку мы каким-то образом внесем маленькие фрагменты рибонуклеиновой кислоты, имеющие точно комплементарную последовательность нужной нам конкретной матричной РНК, то они присоединятся друг к другу. Получится локальный димер, а такие димеры, двуцепочечные РНК, очень не по нраву всякой клетке.
Дело в том, что в норме димеры РНК-РНК в клетках никогда не образуются, единственный их источник — заражение некоторыми вирусами. Только вирусы синтезируют двуцепочечную РНК — клеткам это не нужно, у них даже нет для этого ферментов. Поэтому даже маленький кусочек такой молекулы клетка рассматривает как сигнал заражения вирусом — и полностью ее уничтожает. В ходе этого процесса разрушается не только молекула, образовавшая димер, но и все остальные молекулы с такой же последовательностью. Если двуцепочечная РНК, которую мы внесли в клетку, совпадает по последовательности с каким-либо геном, то все РНК-копии, снятые с этого гена, также уничтожаются.
Рис. 2. Взрослая особь и эмбрион Caenorhabditis elegans. С работ на этом черве (а параллельно и на мухе-дрозофиле) началось открытие механизма РНК-интерференции. Nathan Goehring/Goehring et al. (2011) J. Cell Biol. 193, 583–594.
Внешне действие РНК-интерференции выглядит как «выключение» гена, хотя ДНК, где записана последовательность этого гена, оказывается нетронутой. Эффективность процесса у некоторых организмов настолько велика, что червя Caenorhabditis elegans, например, достаточно просто окунуть в раствор нужных siRNA — и определенный ген полностью отключится во всех его клетках.
В практическом плане открытие РНК-интерференции дало в руки ученым настоящий «пульт управления» геномом, который позволяет выключать нужные гены прямо во время эксперимента, без отбора специальных мутантов.
Со временем, когда механизм РНК-интерференции стали исследовать, обнаружилось много процессов, с ним напрямую не связанных, а как бы находящихся «вокруг» него. Прежде всего, помимо преимущественно антивирусного механизма интерференции, обнаружился механизм сайленсинга, заставляющего «молчать» определенные гены. Сам процесс сильно напоминает РНК-интерференцию, в нем участвуют очень похожие, но все же немного отличающиеся малые некодирующие РНК — микроРНК.
МикроРНК не имеют отношения к вирусам, а кодируются в самом геноме клетки в виде большего предшественника, который нарезается специальными ферментами на кусочки по 22 нуклеотида. Эти короткие молекулы точно так же присоединяются к своим управляемым матричным РНК, но при этом не приводят к их уничтожению, а «глушат» — не дают синтезировать с них белок. За счет использования микроРНК можно, например, накопить множество матричных РНК, которые будут до определенного момента неактивны. Затем их все одновременно можно включить, удалив микроРНК и сняв таким образом ингибирование.
С открытием кольцевых РНК (circRNA) ситуация усложнилась еще на один шаг. Как выяснили в новой работе первооткрыватели молекул-губок, микроРНК сами могут быть объектом ингибирования.
«Молекулы-губки имеют прямое отношение к микроРНК», — комментирует Николай Андреевич Чуриков, заведующий Лабораторией организации генома ИМБ РАН. «Это тот случай, когда мы имеем дело с ингибитором ингибитора. Как было показано в новых работах, кольцевые РНК содержат сайты посадки микроРНК и могут забирать на себя часть этих молекул. Таким образом, они снимают действие микроРНК, которое в подавляющем большинстве случаев является тормозящим. Интересно, что одна кольцевая молекула-губка способна нести на себе сайты посадки разных микроРНК, специфичных к разным генам», — рассказал Чуриков.
Вообще говоря, то, что рибонуклеиновая кислота может существовать в кольцевой форме, было известно давно. Такие кольца образуются при вырезании интронов у ядерных организмов — в процессе сплайсинга, о котором уже заходила речь ранее. Однако в случае обычных интронов кольцевая форма — это просто промежуточное соединение, она быстро разрушается, не выполняя никаких функций. В данном же случае, хотя механизм образования кольца и похож, циклические молекулы выполняют важную задачу — активируют гены, ингибированные микроРНК. С точки зрения биологии, а не химии кольцевые РНК — это действительно нечто совершенно новое.
«В данном случае двум независимым группам — обе их статьи опубликованы в одном номере Nature — удалось показать, что кольцевые РНК — это не недоразумение, что они выполняют важные функции. Например, обе экспериментально изученные РНК (анализ показал, что потенциально таких молекул могут быть тысячи) участвуют в формировании мозга, причем у самых разных животных — от рыб до мышей. И это продемонстрировали достаточно авторитетные, известные ученые. Одна из этих групп, кстати, — это лаборатория Раевского-младшего, его отец, Клаус Раевский, очень известный иммунолог. Интересно, что это потомки как раз тех самых Раевских, которые известны как друзья Пушкина. Помните, когда Александр Сергеевич лечился на Кавказе, он познакомился с Александром Николаевичем Раевским и тот поразил его воображение. Говорят, что „Демон“ написан под этим впечатлением».
Опыты на любимой биологами рыбке данио-рерио показали, что
искусственный синтез большого количества кольцевых РНК приводит к такому же эффекту, как и полное удаление тех микроРНК, сайты посадки которых присутствуют на кольцевой молекуле. У мышей кольцевые РНК синтезируются в определенных областях мозга — неокортексе и гиппокампе, зонах, тесно связанных с формированием памяти.
Обнаружить кольцевые РНК удалось с помощью технологии глубокого секвенирования — RNAseq. Этот недавно появившийся метод позволяет за счет использования современных мощных секвенаторов определять последовательности не отдельных, специально выделенных молекул, а вообще всей РНК в клетке — всего транскриптома.
Интересно, что ранее, когда такой технологии не существовало, кольцевые РНК были практически недоступны для наблюдения. Дело в том, что для определения последовательности нуклеиновых кислот их сначала многократно копируют в ходе полимеразной цепной реакции. Перед этим на концы молекул обычно присоединяют специальные олигонуклеотиды-адапторы. У кольцевых молекул концов, естественно, нет, и адапторы пришивать не к чему. Поэтому такие молекулы длительное время просто «пролетали под радаром» исследователей.
Помимо технологии секвенирования всего транскриптома, для поиска кольцевых молекул понадобился специальный биоинформатический анализ, который может выискивать именно кольцевые молекулы. И хотя на данный момент показать функциональность удалось только для двух кольцевых молекул, анализ говорит о том, что их может быть очень много.
Рис. 3. Эмбрион рыбки данио-рерио, любимый объект нейробиологов. На нем была показана важность функционирования кольцевых РНК для развития мозга. Annie Cavanagh/Wellcome Images.
Одно из самых необычных проявлений РНК-интерференции и РНК-сайленсинга заключается в том, что они делают возможной неслыханную с точки зрения классической генетики вещь — наследование приобретенных признаков. Как уже было сказано выше, интерференция и сайленсинг не изменяют последовательности генов в ДНК, но могут управлять тем, насколько определенные гены будут активны.
Действительно, легко представить, что если в клетки потомства из яйцеклетки попадут регуляторные РНК, они смогут принести с собой определенную схему, паттерн активности генов. Причем, как выясняется, этот паттерн способен наследоваться на протяжении нескольких поколений.
«Яркий пример наследования приобретенных признаков в виде паттерна работы генов, приобретенного на протяжении жизни, хорошо показан на крысах, — рассказывает Чуриков. — Стрессовые условия содержания, приводящие к повышенному уровню гормона кортизола, у грызунов передаются от родителей к детям. Более того, признаки того, что крыс содержали в условиях стресса, отслеживаются на протяжении до четырех поколений. Уверен, что и у людей нечто похожее имеет место. Так что это следует иметь ввиду, особенно тому, кто собирается иметь детей».
Очень похожие передающиеся через поколения эпигенетические эффекты показаны в области поведения и плодовитости животных. Точно такие же механизмы встречаются и у растений, и даже более широко, чем у животных.
Рис. 4. Трофим Лысенко в поле Duncharris/Wikipedia
Малые РНК могут влиять на наследование через поколения не только сами по себе, но и опосредованно. Они могут изменять паттерн активации генов, влияя на расположение в хромосомах активных и пассивых зон. Такие зоны, содержащие в одном случае постоянно работающие, а в другом случае — как бы «заархивированные» гены, собраны в хромосомах в блоки. И некоторые виды некодирующих РНК способны включать или выключать целые блоки генов, привлекая к их границам соответствующие регуляторные белки.
Интересно, что при всей новизне открытых в последние 10 лет механизмов эпигенетической наследственности нельзя сказать, что их внешние проявления представляют собой нечто совершенно новое.
«Я был прошлой осенью в Бостоне на конференции, название которой переводилось примерно как „Наследование через поколения“, представляете, как это звучит для русского уха? — делится впечатлениями Чуриков. — Звучит это как что-то, сильно напоминающее идеи Трофима Денисовича Лысенко. Его там, кстати, вспоминали, даже фотографии показывали. Такая, знаете, монументальная мраморная скульптура вместе со Сталиным. Конечно, история Лысенко, такая трагическая для отечественной биологии, — она не про идеи, а про отношение науки и власти. Ирония, однако, заключается в том, что теперь мы понимаем, какой феномен, эпигенетический феномен, он увидел и поднял на флаг. Жаль, конечно, что это понимание пришло только сейчас».
Автор: Александр Ершов![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
![[livejournal.com profile]](https://www.dreamwidth.org/img/external/lj-userinfo.gif){kind=small}
