«Мы не можем предсказать все токсические побочные эффекты, которыми будет обладать конкретная миРНК», – продолжает доктор Ван. «Чтобы снизить побочные эффекты, мы уже пытались блокировать затравочную область, но до сих пор не пытались полностью ее заменить».

Ученые решили проверить, можно ли заменить затравочную область миРНК затравочной областью микроРНК. В отличие от миРНК, микроРНК – естественный компонент системы экспрессии генов организма. И она тоже может подавлять гены. Поэтому затравочная область микроРНК (с ее природными мишенями) может уменьшить токсические побочные эффекты, вызываемые затравочной областью искусственной миРНК. Кроме того, затравочная область микроРНК могла бы стать еще одним инструментом для выключения других генов, также вызывающих рак.

Группа Вана начала с биоинформатики: для разработки последовательностей миРНК против известного онкогена Akt1, стимулирующего неконтролируемое деление клеток, ученые использовали компьютерный алгоритм. Они выбрали последовательности миРНК против Akt1, которые имели затравочную область очень похожую на таковую микроРНК, известной своей способностью подавлять миграцию клетки. Теоретически замена затравочной области миРНК затравочной областью микроРНК должна привести к объединению функций этих молекул – одновременному снижению пролиферации клеток и ослаблению их способности к движению.

Среди более чем 1000 миРНК, мишенью которых может быть ген Akt1, было найдено только три, затравочная область которых была удивительно похожа на затравочную область микроРНК, подавляющей способность клеток к миграции.

Исследователи заменили затравочную область всех трех найденных миРНК затравочной областью этой микроРНК. Высокое сходство этих двух фрагментов необходимо, так как слишком большое изменение последовательности исходной миРНК сделает ее менее эффективной в подавлении Akt1.

Получившиеся в результате комбинированные молекулы РНК ученые назвали искусственными интерферирующими РНК (artificial interfering RNA, или aiRNA). На основе компьютерных моделей этих последовательностей были созданы «живые» aiRNA, протестированные затем на раковых клетках.

Одна из трех созданных в лаборатории искусственных РНК действительно обладала свойствами исходной миРНК и трансплантированной в нее затравочной области микроРНК. Эта aiRNA значительно подавляла деление клеток (как миРНК) и их подвижность (как микроРНК). Чтобы подтвердить состоятельность своей концепции, доктор Ван и его коллеги сделали полностью противоположное – создали aiRNA, которая делает раковые клетки как резистентными к химиотерапии, так и неспособными к движению.

Ученые, конечно, не собирались повышать выживаемость и подвижность раковых клеток. Они, по словам доктора Вана, «хотели показать, насколько гибкой может быть эта технология». Это преимущество потенциально позволяет использовать ее для лечения не только рака, но и других заболеваний.

Оригинальная статья

«Основанный на модифицированных матричных РНК подход в значительной степени сочетает в себе лекарственную и генную терапию», – объясняет соавтор статьи в Nature Biotechnology Уильям Пу (William Pu), MD. «Так же, как лекарства, модифицированные РНК действуют в течение определенного времени, а затем выводятся из организма. А так как это ген, вы знаете, что он делает, и вам не нужно разрабатывать заменяющий его препарат».

Руководитель исследования Кеннет Чиэнь (Kenneth Chien), MD, PhD, представляет себе модифицированные РНК как способ заставить регенерировать ткань поврежденного сердца. В экспериментах на мышах с моделью инфаркта его лаборатория показала, что модРНК, кодирующая фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), введенная вблизи зоны инфаркта, не только улучшает функцию сердца, но и увеличивает однолетнюю выживаемость с 20 до чуть менее 60 процентов.

У мышей модифицированная РНК, кодирующая фактор роста VEGF-A, заметно улучшает кровоснабжение сердечной мышцы (справа) по сравнению с контролем.
(Фото: vectorblog.org)

Ученые считают, что модРНК VEGF-A работает в основном за счет воздействия на клетки-предшественники, стимулируя их рост и дифференциацию в эндотелиальные клетки, создающие кровеносные сосуды. Хотя VEGF, как уже известно, способствует прорастанию существующих кровеносных сосудов, это его действие – активное влияние на судьбу клеток-предшественников – было неожиданным. Кроме того, эта молекула стимулирует дифференциацию клеток-предшественников в кардиомиоциты, хотя этот эффект выражен слабее.

Немаловажно, что модРНК VEGF-A эффективно проникают в сердечную мышцу и обладает минимальной токсичностью. Чтобы улучшить исход инфаркта и выживание достаточно даже одной дозы, имитирующей естественные клеточные сигналы.

Как средство лечения последствий инфаркта фактор VEGF, стимулирующий рост коллатеральных сосудов, изучается в течение почти двух десятилетий. Но результаты экспериментов на животных неоднозначны, а данные, полученные в клинических испытаниях, неудовлетворительны.

Ученые склоняются к выводу, что причиной тому – технология доставки. «Мы уверены, что большое значение имеют количество и сроки», – комментирует ситуацию доктор Пу.

В экспериментах на мышах лечение модРНК VEGF-A эффективно только в том случае, если прибегнуть к нему сразу после инфаркта, то есть именно тогда, когда организм пытается усилить свой собственный ответ. При этом короткий импульс, по-видимому, работает лучше: длительная экспрессия кодируемого доставленным геном VEGF фактически снижает выживаемость мышей, так как приводит к образованию дисфункциональных сосудов с повышенной проницаемостью.

По мнению доктора Пу, если дать кратковременный сильный паракринный сигнал, можно заставить клетки-предшественники сделать что-то терапевтически полезное и получить устойчивый эффект. «Мы обратились к сигнальным молекулам, потому что так делает сама природа».

Оригинальная статья:

Что касается некодирующих РНК, как мы сейчас их понимаем — малых молекул с регуляторными функциями, то они впервые были обнаружены в конце 1960-х годов.

О том, как это произошло, рассказал Дмитрий Александрович Крамеров, заведующий Лабораторией эволюции геномов эукариот в Институте молекулярной биологии имени Энгельгардта.

«В 1968 году нынешний академик Харрис Буш и его сотрудники с одной стороны, а также Роберт Вайнберг совместно с Шелдоном Тенноном с другой стороны обнаружили молекулы длиной всего 90–300 нуклеотидов, которые не были похожи ни на матричные, ни на транспортные РНК. Исследователи просто разделяли в гелях всю РНК, которую им удалось выделить из клеток млекопитающих, и случайно обнаружили эти относительно короткие молекулы. Их было значительно меньше, чем известных к тому моменту рибосомных и матричных РНК, но все-таки не так уж и мало.

И вот, на протяжении многих лет эти исследователи медленно и мучительно определяли последовательность этих молекул, одну за другой. Тогда они еще не знали, какие функции могут выполнять эти странные короткие РНК. В некотором смысле ученые работали на будущее. Впервые какую-то функцию у таких РНК удалось обнаружить только при исследовании сплайсинга. Это открытие принадлежит очень сильной женщине-ученому Джоан Стейтс».

Сплайсинг — это процесс, в ходе которого матричные РНК, непосредственно «переписанные» с ДНК, подготавливаются к тому, чтобы стать основой для синтеза белка. Из них вырезаются лишние участки — интроны. Оказалось, что

в процессе вырезания этих вставок участвуют малые некодирующие РНК. Белки в этом тоже участвуют, вместе с РНК они образуют большой комплекс, проводящий вырезание, — сплайсосому (структуру сплайсосомы удалось установить только недавно). Но именно РНК — они называются U1, U2, U3 и так далее — выполняют здесь основную работу.

Рис. 1. Большая субъединица
рибосомы, состоящая из РНК
(кремового цвета) и белка
(синего). Видно, что РНК является
основой этой машины трансляции,
а белок — всего лишь «довесок»,
играющий вспомогательную роль.
David S. Goodsell

Следующая малая РНК, функцию которой удалось установить, оказалась занята в процессе, никак не связанном со сплайсингом.

«Практически одновременно появились первые работы по так называемым 7S-РНК, которые входят в состав комплексов, отвечающих за экспорт белков из клетки, — SPR-частиц, — продолжает Крамеров. — Эти РНК присоединяются к первым аминокислотам белков, которые требуется экспортировать, и связывают их со специальным каналом. Это необходимо, например, для выделения пищеварительных ферментов или выработки белков крови. У каждого из таких „идущих на экспорт“ белков первые аминокислоты представляют собой определенную сигнальную последовательность, что-то вроде „разрешения на вывоз“.

Вот эта 7S-РНК как раз связывается с такой последовательностью и обеспечивает экспорт».

Со временем стало понятно, что малые некодирующие РНК встречаются в совершенно разных сферах клеточной деятельности: сплайсинг, синтез белка, экспорт белка. Были открыты малые ядрышковые РНК — молекулы, которые участвуют в модификации нуклеотидов рибосомальной РНК. Чем дальше, тем больше становилось разнообразие таких молекул, однако все они были достаточно специализированными, и такие исследования не привлекали широкого внимания. «Поначалу работа двигалась очень медленно.

Открытие роли 7S-РНК в экспорте белков, например, заняло, около пятнадцати лет. Однако в последние несколько лет новый вид малых РНК открывают чуть ли не каждый год», — рассказывает ученый.

Все изменилось относительно недавно, в 1998 году, когда Эндрю Файр и Крейг Меллоу открыли явление РНК-интерференции — способа управления работой генов, который осуществляется за счет так называемых малых интерферирующих РНК, или siRNA. Эта работа практически произвела революцию в молекулярной биологии.

• Во-первых, был обнаружен совершенно новый, неизвестный механизм регуляции работы генов.


• А во-вторых, что немаловажно, новый механизм можно было немедленно применить на практике.

Возможно, именно поэтому Нобелевскую премию Файр и Меллоу получили уже в 2006 году — спустя всего восемь лет после открытия.

В общих чертах механизм РНК-интерференции выглядит следующим образом. Как известно, для того чтобы синтезировать белок, нужно сначала снять одноцепочечную РНК-копию гена с ДНК в ядре. Созревшая матричная РНК поступает в цитоплазму, где находятся рибосомы. Однако если в клетку мы каким-то образом внесем маленькие фрагменты рибонуклеиновой кислоты, имеющие точно комплементарную последовательность нужной нам конкретной матричной РНК, то они присоединятся друг к другу. Получится локальный димер, а такие димеры, двуцепочечные РНК, очень не по нраву всякой клетке.

Дело в том, что в норме димеры РНК-РНК в клетках никогда не образуются, единственный их источник — заражение некоторыми вирусами. Только вирусы синтезируют двуцепочечную РНК — клеткам это не нужно, у них даже нет для этого ферментов. Поэтому даже маленький кусочек такой молекулы клетка рассматривает как сигнал заражения вирусом — и полностью ее уничтожает. В ходе этого процесса разрушается не только молекула, образовавшая димер, но и все остальные молекулы с такой же последовательностью. Если двуцепочечная РНК, которую мы внесли в клетку, совпадает по последовательности с каким-либо геном, то все РНК-копии, снятые с этого гена, также уничтожаются.

Рис. 2. Взрослая особь и эмбрион Caenorhabditis elegans. С работ на этом черве (а параллельно и на мухе-дрозофиле) началось открытие механизма РНК-интерференции. Nathan Goehring/Goehring et al. (2011) J. Cell Biol. 193, 583–594.

Внешне действие РНК-интерференции выглядит как «выключение» гена, хотя ДНК, где записана последовательность этого гена, оказывается нетронутой. Эффективность процесса у некоторых организмов настолько велика, что червя Caenorhabditis elegans, например, достаточно просто окунуть в раствор нужных siRNA — и определенный ген полностью отключится во всех его клетках.

В практическом плане открытие РНК-интерференции дало в руки ученым настоящий «пульт управления» геномом, который позволяет выключать нужные гены прямо во время эксперимента, без отбора специальных мутантов.

Со временем, когда механизм РНК-интерференции стали исследовать, обнаружилось много процессов, с ним напрямую не связанных, а как бы находящихся «вокруг» него. Прежде всего, помимо преимущественно антивирусного механизма интерференции, обнаружился механизм сайленсинга, заставляющего «молчать» определенные гены. Сам процесс сильно напоминает РНК-интерференцию, в нем участвуют очень похожие, но все же немного отличающиеся малые некодирующие РНК — микроРНК.

МикроРНК не имеют отношения к вирусам, а кодируются в самом геноме клетки в виде большего предшественника, который нарезается специальными ферментами на кусочки по 22 нуклеотида. Эти короткие молекулы точно так же присоединяются к своим управляемым матричным РНК, но при этом не приводят к их уничтожению, а «глушат» — не дают синтезировать с них белок. За счет использования микроРНК можно, например, накопить множество матричных РНК, которые будут до определенного момента неактивны. Затем их все одновременно можно включить, удалив микроРНК и сняв таким образом ингибирование.

С открытием кольцевых РНК (circRNA) ситуация усложнилась еще на один шаг. Как выяснили в новой работе первооткрыватели молекул-губок, микроРНК сами могут быть объектом ингибирования.

«Молекулы-губки имеют прямое отношение к микроРНК», — комментирует Николай Андреевич Чуриков, заведующий Лабораторией организации генома ИМБ РАН. «Это тот случай, когда мы имеем дело с ингибитором ингибитора. Как было показано в новых работах, кольцевые РНК содержат сайты посадки микроРНК и могут забирать на себя часть этих молекул. Таким образом, они снимают действие микроРНК, которое в подавляющем большинстве случаев является тормозящим. Интересно, что одна кольцевая молекула-губка способна нести на себе сайты посадки разных микроРНК, специфичных к разным генам», — рассказал Чуриков.

Вообще говоря, то, что рибонуклеиновая кислота может существовать в кольцевой форме, было известно давно. Такие кольца образуются при вырезании интронов у ядерных организмов — в процессе сплайсинга, о котором уже заходила речь ранее. Однако в случае обычных интронов кольцевая форма — это просто промежуточное соединение, она быстро разрушается, не выполняя никаких функций. В данном же случае, хотя механизм образования кольца и похож, циклические молекулы выполняют важную задачу — активируют гены, ингибированные микроРНК. С точки зрения биологии, а не химии кольцевые РНК — это действительно нечто совершенно новое.

«В данном случае двум независимым группам — обе их статьи опубликованы в одном номере Nature — удалось показать, что кольцевые РНК — это не недоразумение, что они выполняют важные функции. Например, обе экспериментально изученные РНК (анализ показал, что потенциально таких молекул могут быть тысячи) участвуют в формировании мозга, причем у самых разных животных — от рыб до мышей. И это продемонстрировали достаточно авторитетные, известные ученые. Одна из этих групп, кстати, — это лаборатория Раевского-младшего, его отец, Клаус Раевский, очень известный иммунолог. Интересно, что это потомки как раз тех самых Раевских, которые известны как друзья Пушкина. Помните, когда Александр Сергеевич лечился на Кавказе, он познакомился с Александром Николаевичем Раевским и тот поразил его воображение. Говорят, что „Демон“ написан под этим впечатлением».

Опыты на любимой биологами рыбке данио-рерио показали, что

искусственный синтез большого количества кольцевых РНК приводит к такому же эффекту, как и полное удаление тех микроРНК, сайты посадки которых присутствуют на кольцевой молекуле. У мышей кольцевые РНК синтезируются в определенных областях мозга — неокортексе и гиппокампе, зонах, тесно связанных с формированием памяти.

Обнаружить кольцевые РНК удалось с помощью технологии глубокого секвенирования — RNAseq. Этот недавно появившийся метод позволяет за счет использования современных мощных секвенаторов определять последовательности не отдельных, специально выделенных молекул, а вообще всей РНК в клетке — всего транскриптома.

Интересно, что ранее, когда такой технологии не существовало, кольцевые РНК были практически недоступны для наблюдения. Дело в том, что для определения последовательности нуклеиновых кислот их сначала многократно копируют в ходе полимеразной цепной реакции. Перед этим на концы молекул обычно присоединяют специальные олигонуклеотиды-адапторы. У кольцевых молекул концов, естественно, нет, и адапторы пришивать не к чему. Поэтому такие молекулы длительное время просто «пролетали под радаром» исследователей.

Помимо технологии секвенирования всего транскриптома, для поиска кольцевых молекул понадобился специальный биоинформатический анализ, который может выискивать именно кольцевые молекулы. И хотя на данный момент показать функциональность удалось только для двух кольцевых молекул, анализ говорит о том, что их может быть очень много.

Рис. 3. Эмбрион рыбки данио-рерио, любимый объект нейробиологов. На нем была показана важность функционирования кольцевых РНК для развития мозга. Annie Cavanagh/Wellcome Images.

Одно из самых необычных проявлений РНК-интерференции и РНК-сайленсинга заключается в том, что они делают возможной неслыханную с точки зрения классической генетики вещь — наследование приобретенных признаков. Как уже было сказано выше, интерференция и сайленсинг не изменяют последовательности генов в ДНК, но могут управлять тем, насколько определенные гены будут активны.

Действительно, легко представить, что если в клетки потомства из яйцеклетки попадут регуляторные РНК, они смогут принести с собой определенную схему, паттерн активности генов. Причем, как выясняется, этот паттерн способен наследоваться на протяжении нескольких поколений.

«Яркий пример наследования приобретенных признаков в виде паттерна работы генов, приобретенного на протяжении жизни, хорошо показан на крысах, — рассказывает Чуриков. — Стрессовые условия содержания, приводящие к повышенному уровню гормона кортизола, у грызунов передаются от родителей к детям. Более того, признаки того, что крыс содержали в условиях стресса, отслеживаются на протяжении до четырех поколений. Уверен, что и у людей нечто похожее имеет место. Так что это следует иметь ввиду, особенно тому, кто собирается иметь детей».

Очень похожие передающиеся через поколения эпигенетические эффекты показаны в области поведения и плодовитости животных. Точно такие же механизмы встречаются и у растений, и даже более широко, чем у животных.

Рис. 4. Трофим Лысенко в поле Duncharris/Wikipedia

Малые РНК могут влиять на наследование через поколения не только сами по себе, но и опосредованно. Они могут изменять паттерн активации генов, влияя на расположение в хромосомах активных и пассивых зон. Такие зоны, содержащие в одном случае постоянно работающие, а в другом случае — как бы «заархивированные» гены, собраны в хромосомах в блоки. И некоторые виды некодирующих РНК способны включать или выключать целые блоки генов, привлекая к их границам соответствующие регуляторные белки.

Интересно, что при всей новизне открытых в последние 10 лет механизмов эпигенетической наследственности нельзя сказать, что их внешние проявления представляют собой нечто совершенно новое.

«Я был прошлой осенью в Бостоне на конференции, название которой переводилось примерно как „Наследование через поколения“, представляете, как это звучит для русского уха? — делится впечатлениями Чуриков. — Звучит это как что-то, сильно напоминающее идеи Трофима Денисовича Лысенко. Его там, кстати, вспоминали, даже фотографии показывали. Такая, знаете, монументальная мраморная скульптура вместе со Сталиным. Конечно, история Лысенко, такая трагическая для отечественной биологии, — она не про идеи, а про отношение науки и власти. Ирония, однако, заключается в том, что теперь мы понимаем, какой феномен, эпигенетический феномен, он увидел и поднял на флаг. Жаль, конечно, что это понимание пришло только сейчас».