─ Не могли бы вы более конкретно рассказать об этих работах?

─ В течение нескольких лет мы могли выращивать эмбриональные человеческие стволовые клетки в культурах. Стволовые клетки – это очень мощные клетки, потому что они способны формировать самые разные типы клеток, что позволяет нам изучать сложные виды клеток в культурах. За последние несколько лет исследовательские группы в Японии, а также в Австрии разработали методы, позволяющие стволовым клеткам получать сложные формы в культурах, которые выглядят, как частички тела. Группе Йошики Сасаи (Yoshiki Sasai) в Японии удалось получить эмбриональные стволовые клетки в культурах и превратить их в то, что выглядит, как глаз. А совсем недавно лаборатория Юргена Кноблиха (Juergen Knoblich) в Австрии добилась того, что стволовые клетки сформировали нечто, что сильно напоминает кору головного мозга человека, и некоторые специалисты называют полученный результат органоидом или мини-мозгом. Мы знаем, что многие ключи развития находятся в тех процессах, которые происходят в контексте структурных образований и в сложной окружающей среде, в которой развиваются стволовые клетки. И таким образом теперь мы видим, что стволовые клетки могут воспроизводиться – и не только как тип клетки, но и как структура и как окружающая среда, где клетки взаимодействуют друг с другом сложным образом и где сигналы, передаваемые от одной клетки к другой, могут оказывать влияние на развитие. Изучение подобных сложных структур в лабораторных условиях позволяет нам получить значительно более совершенную модель того, что происходит в человеческом мозге на ранних стадиях развития.

─ Какими вопросами вы сможете заняться, если эти технологии будут улучшены?

─ Один из важных вопросов, которым мы можем заняться с помощью новых средств, – это изучение механизмов болезней человека. Некоторые из них можно очень хорошо моделировать в мышах и таким образом получить мутацию у мыши, а затем изучить механизм функционирования болезни в человеческом мозгу. Однако похоже на то, что другие гены у человека и у мыши сильно отличаются друг от друга, и поэтому мы получаем лишь примитивное представление о том, что они делают в человеке, когда мы изучаем их поведение в мышах. Таким образом, человеческие стволовые клетки позволяют углубить наши знания, и есть возможность добавить к ним то, что получено в процессе работы с мышами, а также результаты прямого изучения человеческих клеток.

─ Есть ли возможность улучшить работу этих систем?

─ Потрясающее впечатление произвела способность стволовых клеток формировать такие эмбриональные структуры, как сетчатка и мозг. Это все равно что наблюдать за собакой, танцующей на задних лапах – вы в восторге от того, что она может это делать. Но для того, чтобы мини-мозг стал на самом деле точным научным инструментом, мы должны будем придумать способы надежного и воспроизводимого выращивания подобных структур, мы должны уметь делать это многократно для того, чтобы понять, что происходит в тот момент, когда данный процесс прерывается.

В настоящее время нам удается сделать это лишь время от времени. И так происходит всегда в науке, когда делаются первые шаги. Однако я уверен в том, что технические усовершенствования мы увидим уже в самое ближайшее время.

─ Разрабатываются ли другие технологии?

─ Люди хотят узнать, сможем ли мы лучше понять работу мозга, если поместим человеческие клетки в мозг мыши и позволим им там развиваться. Это даст возможность небольшому количеству человеческих клеток развиться в крупный мозг мыши в относительно нормальной среде, где мы сможем увидеть, как они образуют из себя соответствующие структуры.

Другой способ состоит в том, чтобы дать возможность органоидам из стволовых клеток развиваться до такого момента, когда они на самом деле будут иметь прочные связи, которые мы сможем изучать с помощью технологий, позволяющих нам наблюдать за электрической активностью нейронов. Таких возможностей мы пока не имеем, но сегодня мы уже готовы приступить к работе по созданию сложных структур в пробирке.

В статьях, посвященных органоидам, приводятся данные о происходящей в них электрической активности, однако там нет результатов специально проведенных исследований детальной электрической активности. Из того, что на сегодняшний день было уже показано, можно сделать вывод о том, что это можно сделать.

─ Это волнующее событие?

─ Это нечто потрясающее. Такие расстройства, как умственная отсталость и аутизм, являются дисфункцией электрической активности, протекающей между нейронами. Однако мы считаем, что устройство нашего мозга довольно сильно отличается от мозга мыши. Поэтому было бы интересно понаблюдать за тем, что делают гены аутизма в реальном человеческом мозге. Такие когнитивные расстройства, как аутизм, умственная отсталость и шизофрения, являются весьма обширными областями, потому что мыслительные способности человека намного отличается от мыслительной способности мыши.

─ Существуют ли другие исследования, где подобные модели могут оказаться полезными?

─ Применение подобных способов может быть полезным при изучении функций тех генов, которые регулируют развитие человеческого мозга, но они функционируют иначе у мышей, поскольку у человека они находятся под эволюционным давлением. Можно взять один из примеров из статьи Кноблиха. Речь идет о гене CDK5RAP2, который регулирует деление клеток в мозгу, и поэтому он регулирует также размер мозга. Этот ген вызывает микроцифалию в том случае, если он подвергся мутации в человеческом организме, но продолжает регулировать поведение нейронных стволовых клеток человека.

Ученые научились конструировать связывающийся с ДНК сегмент TALE-белков так, чтобы они взаимодействовали именно с нужной последовательностью ДНК. Обычно они присоединяют ДНК-связывающий сегмент к сегменту другого белка, который может выполнять определенную нужную функцию в нужном месте – например, к фрагменту фермента, разрезающего ДНК. В общей сложности лаборатории Барбаса и других ученых разработали уже тысячи таких мощных основанных на TALEs редактирующих ДНК белков.

Тем не менее основанное на TALEs редактирование ДНК имеет существенное ограничение. Мишенями практически всех открытых до сих пор природных TALEs являются последовательности ДНК, начинающиеся с нуклеозида тимидина, обозначаемого в четырехзначном ДНК-коде буквой «Т». Структурные исследования показали, что природные белки TALEs не могут связываться с ДНК без этого Т в начале последовательности, и молекулярные биологи считали, что правило «T-ограничения» применимо к любому инженерному TALE-белку.

«Однако никто не исследовал, действительно ли этот начальный тимидин необходим множеству существующих на сегодня искусственных TALE-белков и ферментов, с должной тщательностью», – говорит Брайан Лэмб (Brian Lamb), научный сотрудник лаборатории профессора Барбаса, первый автор статьи.

Лэмб начал с оценки того, насколько хорошо основанные на TALE белки функционируют с их обычными ДНК-мишенями, если первой буквой последовательности ДНК является не Т, а один из трех других нуклеозидов (A, G или C). Используя библиотеку природных и инженерных TALE-белков, он нашел веские свидетельства в пользу «T- ограничения». «Активность TALE-белков отличалась на порядки – некоторые из оцененных нами TALEs теряли до 99,9% активности, если мы изменяли первое основание», – говорит Лэмб.

Но ученый не был готов отказаться от идеи создания TALE-белков с более широкими возможностями. Для этого он адаптировал метод «направленной эволюции», разработанный в прошлом году профессором Эндрю Мерсером (Andrew Mercer), в то время также научным сотрудником лаборатории Барбаса. Сначала Лэмб создал большую библиотеку новых TALE-белков, случайным образом отличающихся структурой, «захватывающей» начальный нуклеозид, а затем проверил новые TALEs в серии тестов, чтобы выбрать – в ускоренной версии естественной эволюции – те, которые работают адекватно даже с не-T нуклеозидом в начале их целевой ДНК-последовательности.

Так он нашел несколько новых TALEs, не подчиняющихся «Т-ограничению». Один из них предпочитает связываться с ДНК, начинающейся с гуанозина (G). Другие достаточно хорошо связываются c последовательностями, начинающимися с любого из четырех нуклеозидов. Кроме того, Лэмб убедился в том, что эти не ограниченные «Т-правилом» TALEs работают, как задумано, и будучи соединенными, например, с фрагментами разрезающих ДНК ферментов.

«По существу, мы отменили T-ограничение», – уверен ученый. «Это означает, что количество сайтов ДНК, которые могут стать мишенями основанных на TALEs белков, и точность, с которой мы можем воздействовать на мишени в том или ином гене, значительно возросли», – говорит профессор Барбас.

Он и его группа планируют продолжить разработку потенциальных методов генной терапии, основанных на новых TALE-белках в качестве инструментов. Но снятие «T-ограничения» в редактировании ДНК должно оказать мощное влияние и на развитие молекулярной биологии, биотехнологий, методов лечения, основанных на стволовых клетках, и нанотехнологий, например, на создание ДНК-оригами. Практически выгоду от этого прорыва получает любая область, требующая манипуляций с ДНК – будь то в живых клетках или при конструировании основанных на белках и ДНК механизмов.

«Число потенциальных применений этой технологии, вероятно, больше, чем можно себе представить», – заключает профессор Барбас.

Оригинальная статья

Directed evolution of the TALE N-terminal domain for recognition of all 5' bases

Источник: http://www.scripps.edu/…6barbas.html