Предполагается, что данные, собранные японскими учёными, существенно поспособствуют выявлению молекулярных механизмов сегрегации хромосом — ключевого аспекта развития ряда заболеваний, включая онкологические болезни и врождённые дефекты.

В клетках молекулы Xkid локализованы внутри аппарата веретена деления — структуры необходимой для осуществления деления клеток, состоящей из скопления микротрубочек. Определение перемещений Xkid, происходящих в естественных условиях, называют ключом к пониманию механизмов сегрегации хромосом в ходе клеточного деления.

Хоть организм человека и образован множеством различных частей: мышцами, внутренними органами, головным мозгом и т.д. — развивается он из одной структуры — оплодотворённой яйцеклетки, которая претерпевает множество делений, образуя человеческую особь. На каждом этапе деления хромосомы должны быть точно сегрегированны — располагаться в образующихся клетках строго определённым образом. Хромосомы — это источник генетической информации. Неправильная сегрегация хромосом может приводить к развитию различных заболеваний, включая онкологические болезни.

Известно, что молекулярная машина Xkid принципиально важна для правильного расположения хромосом в клетке в ходе деления. Ранее функции Xkid были изучены in vitro. Тогда учёные использовали полученные из клеточных экстрактов очищенные белки Xkid, показав, что они определённым образом выстраиваются вдоль микротрубочек. Механизм поведения Xkid в интактном веретене деления требовал изучения. Веретено деления является строго организованной структурой, которая образуется из микротрубочек. Для того, чтобы расширить представления о сегрегации хромосом во время клеточного деления, необходимо выяснить то, как передвигается молекулярная машина Xkid в естественных условиях. Исследование, проведённое Японскими учёными, как раз и проливает свет на передвижение Xkid в интактном веретене деления.

От авторов исследования

Мы обнаружили, что

Xkid передвигается на существенные расстояния (около 5 мкм; максимум 17 мкм) вдоль ориентированных определённым образом микротрубочек, двигаясь от одной микротрубочки к другой во время своего перемещения. Мы так же наблюдали движение Xkid преимущественно в направлении, соответствующем полярным областям микротрубочек, приводящее к накоплению Xkid на экваторе веретена деления. Это согласуется со сборкой и расположением хромосом около экватора веретена деления в метафазе.

Результаты нашего исследования впервые демонстрируют на молекулярном уровне роль Xkid в направлении хромосом к экватору веретена деления. Около полюсов веретена деления больше молекул Xkid двигаются в направлении экватора веретена деления (экваториальный тип движения), в то время как около экватора веретена деления все типы движения наблюдались с одинаковой частотой.

Полярные области и длина микротрубочек были симметричными относительно экватора веретена деления и соответствовали преобладающему направлению перемещений Xkid.

Более подробное описание результатов проведённого исследования можно найти в журнале Nature.

Science Daily   sci-lib.com

Электронный микроскоп: возможность видеть молекулы

Электронный микроскоп отличается от привычного нам оптического почти так же сильно, как компьютер отличается от печатной машинки. В этом приборе не используется свет: иначе говоря, мы никогда не сможем увидеть ДНК под ним в полном смысле этого слова. Размеры и форму объектов можно определить благодаря потоку электронов, которыми «обстреливают» молекулярные структуры. Частицы ударяются о свою мишень, отскакивают в разные стороны, и по траектории их полета ученые могут составить изображение того, что находится под электронным микроскопом.

Мы пока неспособны сфотографировать отдельную молекулу ДНК — знаменитую двойную спираль с двумя палочками сахаро-фосфатных стержней и миниатюрными перемычками — нуклеотидами. Для наблюдения за таким хрупким объектом наши электронные микроскопы слишком грубы, и потоки частиц неизменно успевают разбить структуру раньше, чем будет составлено ее изображение. Однако в начале 2012 года группе ученых из Генуи удалось запечатлеть «веревочку» ДНК, составленную из шести молекул, обернутых вокруг еще одной, седьмой. Для этого им пришлось создать абсолютно новую подложку с микроскопическими опорами, на которых ДНК была натянута, как телеграфный провод на столбах.

Микропипетка: перенос ДНК

Современные микропипетки — это высокоточные инструменты, способные дозировать крошечные объемы жидкости: от 1 до 1000 микролитров. Их можно найти в любой лаборатории или исследовательском центре, где проводится ПЦР-диагностика или другие генетические исследования.

Внешне микропипетки одновременно напоминают шприцы и шариковые ручки. В отличие от обыкновенной пипетки с мягким резиновым колпачком, микропипетка обладает крошечным тонким поршнем. Специалист просто нажимает на него большим пальцем, как на кнопку, поршень входит в узкий стеклянный капилляр, вытесняя из него воздух или жидкость. У микропипеток часто есть цветовая маркировка, чтобы можно было различить устройства разного объема. Также встречаются микропипетки с несколькими капиллярами — так называемыми «многоканальными модулями». Такие устройства позволяют забирать одинаковый объем жидкости сразу из нескольких пробирок или контейнеров.

Микроманипулятор — это прибор, позволяющий осуществлять тонкие и точные движения микроинструментов. С его помощью можно удалить или перенести клеточное ядро, сделать инъекцию в цитоплазму и др. Без приборов, руками эти действия выполнить невозможно: слишком мало давление, которое можно приложить к крошечному клочку материи. Вот почему все нужно делать с помощью джойстика и механизма, снижающего силу движения человеческих пальцев.

Микроманипулятор состоит из системы штативов с винтами, которые зажимают микроинструменты и обеспечивают их движение во всех направлениях. Также для работы необходима влажная масляная камера. Слой масла нужен, чтобы удержать клетку на месте и предохранить ее от высыхания.

Именно с помощью микроманипулятора специалисты проводят искусственное оплодотворение. Также прибор незаменим в генетических исследованиях: все инъекции растворов, в том числе, внесение в одиночную клетку новой ДНК in vitro, осуществляются с использованием микроманипулятора.

Биолистическая пушка — один из самых распространенных инструментов генной инженерии растений (особенно однодольных: пшеницы, ячменя, кукурузы и др.). Она стреляет частицами вольфрама, на которые перед работой напыляют ДНК. Специалисты наносят эти «генетические пули» на целлофановую подложку и помещают в пушку. Под «стволом», на расстоянии 10-15 см, устанавливают чашку с растительной тканью, или каллусом — клетками, которые позже можно будет культивировать. После этого происходит выстрел. Вакуумный насос резко уменьшает давление в «стволе», и пушка на огромной скорости выбрасывает вольфрамовые частички. Они разрывают стенки клеток, без труда входят в цитоплазму и ядра клеток и доставляют туда ДНК. Из–за силы бомбардировки ткань по центру чашки, как правило, погибает. Однако по периметру клетки остаются живы и хорошо протрансформированы. Их и культивируют в дальнейшем, чтобы получить трансгенный сорт растения.

Электропоратор — еще один прибор для трансформации клеток живых существ: от бактерий и дрожжей до млекопитающих, а также растений. Перед работой раствор с живыми клетками и дополнительными молекулами ДНК помещают в пластиковые кюветы с алюминиевыми электродами. Затем электропоратор с помощью электрического поля создает в мембранах клеток крошечные поры, сквозь которые генетические конструкции проникают в цитоплазму. После завершения процесса поры закрываются, и клетки остаются целы и невредимы.

Сегодня электропорация считается самым простым и эффективным методом введения молекул ДНК в клетки. До недавнего времени он, впрочем, использовался не так часто из–за отсутствия серийного производства электропораторов.

Амплификатор можно найти практически в любом медицинском центре, где проводятся генетические исследования. Он и позволяет проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР), после которой специалисты уже с помощью другого прибора находят, идентифицируют и подсчитывают различные фрагменты ДНК. Амплификаторы применяются при проведении клинических анализов и судмедэкспертизы, в ходе научных исследований, а также для экологического и санитарного контроля.

Метод ПЦР (полимеразной цепной реакции) основан на поиске и многократном копировании определенных участков ДНК, которые соответствуют заданным критериям. Для этого используется особый фермент — полимераза. Весь процесс протекает in vitro.

В ходе ПЦР специалисты нагревают и охлаждают пробирки с образцами, полимеразой и праймерами — короткими фрагментами нуклеиновой кислоты, комплементарными ДНК- или РНК-мишени. Мишенями всегда являются одиночные нити ДНК, к которым в определенном месте должен присоединиться праймер.

Процесс начинается с того, что температуру в пробирках повышают до 94-98°С. В этот момент водородные связи в двойных спиралях распадаются, и все одиночные цепочки оказываются сами по себе. Затем пробирки начинают охлаждать, чтобы праймеры с помощью новых водородных связей могли связаться со своими мишенями и образовать молекулы. Ну, а после этого, на финальной стадии, в дело вступает фермент, который на основе получившихся структур синтезирует множество дочерних ДНК — точных копий родительской молекулы. Они и нужны специалистам, чтобы провести анализ.

Анализатор нуклеиновых кислот, или АНК, — второй необходимый для ПЦР-диагностики прибор. Когда реакция завершается, в это устройство переносят «переживший» полимеразную цепную реакцию образец. Ученые с помощью АНК подсчитывают, сколько искомых молекул возникло в пробирке, а также оценивают их качества.

Сегодня существуют анализаторы нуклеиновых кислот, которые работают в режиме реального времени. При наличии такого прибора амплификатор специалистам не нужен: весь процесс, от стадии нагревания пробирок до подсчета молекул прибор выполняет сам.

Секвенирование — это процесс определения последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК. Именно оно позволяет нам читать геномы и исследовать их. Правда, сегодня не существует ни одного метода, который работал бы для всей молекулы целиком. Чтобы определить, как расположены нуклеотиды в ниточке ДНК, специалистам всегда приходится сначала разделить ее на множество небольших участков. Затем ученые проводят ПЦР: нагревают и охлаждают эти «генетические кусочки» в пробирках с праймерами и ферментом. В результате появляется множество копий искомого участка ДНК. Секвенатор может прочитать каждую из них.

Наталия Киеня.